Kromotografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben tentang terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan tarhadapKLT sebagai pencari kodisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara terpisah secara sempurna
Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengn zat padat aktif seperti alumino dan selika jel sebagai efase diam. Zat yang dimasuakn lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat diserap dari larutan secara sepurna oleh zat penyerapan berupa pita sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda, sehingga terjadi pemisahan dalam kolom. Hasil pemisahan ini disebut kromatogram
Umumnya pada kk digunakan campuran homogen seperti campuran gasdilakukan pada suatu penyerap (absorbent). Komponen penyusun campur akan diserap oleh adsoben adalah 1banding 50
Metode ini dapat memisahkan zat dari 100 mg sampai 5mg bahkan lebih.pemisahan campuran baik bila harga Rf = 0.6. tekhnik kk paling sesuai untuk pemisahan hasil isolasi dari pengotornya
Pemisahan denagan kk biasanya digunakan absorben yang paling umum : alumunium oksida ( AL2 O3) yang mempunyai daya absorsi atau kereaktifan yang diatur secara cepat sehingga penggunaan memberikan hasil yang baik. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantun pada sifat fisika komponen tersebut.
Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan absorben, komponen cairan lainya akan mengalir kebawah . jadi semakin lemah kemungkinan cairan itu teradsopsi semakin cepat komponen itu mengalir ke bawah
Bila kecepatan gerak cairam itu lebih besar dari pada kecepatran absorbsi oleh absorben.
Prinsip-prisip kerja k.kolom
– Berdasarkan kepada perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap.
Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat.
Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut/ dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus shingga terjadi pemisahan dalam kolom.
Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat:
– Daya serap adsorben.
– Sifat pelarut.
– Suhu sistem kromotografi.
Kecepatan turunan sampel dipengaruhi oleh :
– Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat.
– Panjan absorban
Makin panjan makin cepat turunnya senyawa.
- Ukuran artikel absorben
- Rongga udara dalam absorben.
- Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan terganggu.
Fektor yang mempengaruhi proses pemisahan:
– Daya serap adsoben.
– Jenis / sifat eluen
– Suhu kromotografi
– Pelarut yang di gunakan
Cara mengetahui senyawa yang dipisahkan setelah motografi:
– Bila komponen cairan yang akan di pisahkan itu berwarna, maka dapat dilihat pita warna dalam kolom. Jika zat terpisah berwarna/ berfluariensi dengan menggunakan sinar uv, kolom penyerap dapat dikeluarkan dengan cara di potong melintang lapisan yang diperlukan dipisahkan / dapat juga zat tersebut disaring dari tiap lapisan dengan pelerutan yang cocok.
– Jika zat dipisahkan tidak berwarna, letak lapisan zat dapat di ketahui dengan cara memberi warna/ menyemprot kolom dengan zat yang membentuk warna, kemudian elarutnya di uapkan dengan pelarutan diuapkan dengan pengurangan tekan guna mencegah supaya jaringan terjadi perusakan pada senyawa kajian. Bila suatu pemisah sukar di pisahkan / dilakukan maka diperlukan maka diperlukan pengumpulan lebih banyak faksi otomatis.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kk.
– Kolom, tergantung pada banyak zat yang dipisahkan.
– Fase gerak (eluen) dicocokan polar/tidaknya.
– Adsorben, harus bebas dari air contoh Al2o3. silika gel.
– Fase diam, biasanya aluminium oksida.
o Jenis adsorben yang umum dipkai dalam kk:
– Tepung selulosa
– Tepung kanji
– Karbonat
– Aksida
– Silika gel.
Cara pengisean kolom:
1. cara basah
– Isi dasar kolom dengan kapas
– Masukan eluen
– Campuran dengan rata sebagai adsorbendan eluen menjadi homogen
– Jangan digoyang kurang lebih enam jam
– Setelah stabil masukan eluen dan azat dan keluarkan eluen
2. cara kering
– Isi tabung dengan kapas
– Masukan eluen
– Masukan adsorbenkeringsedikit sebagai di aduk
Pebedaan cara basah dan kering adalah :
– Cara basah.
Eluen di campurkan dengan obsorden secara merata sebelum di isikan ke dalam kolom.
– Cara kering
Eluen dimasukan lebih dahulu, kemudian adsorben kering di masukan sedikit ke dalam kolom sambil di aduk.
Dalam memilih adsorben harus diperhatikan:
– Sifatnya.
– Besar pratikelnya dan horgenitasnya
Kelemahan dari kk:
– Pemisahan berjalan lambat
– Tidak dapat dipakai jika partikel terlalu kecil
– Penyerapan tidak dapat dibolak balik.
Pembuktian suatu senyawa telah murni dapat dilakukan dengan cara :
– Pengujian fisika
o Dengan membandingkan sifat yang di dapatkan, berdasarkan listrik, jika angka perbedaannya kecil maka senyawa itu punya
– Kk kemurnian yang tinggi
– Khusus untuk senyawa yang belum di kenal. Kemudian dapat diketahui melalui KLT
